翻译组简介
翻译组研究可帮助科研人员发现及鉴定新蛋白，从翻译水平探究基因表达对疾病影响的机制以及解释转录水平与蛋白水平结果不一致等问题。近年来，翻译组的应用越来越广泛，研究人员结合翻译组与转录组的数据，在探究肿瘤发生发展机制、发育调控、神经科学等领域产出了不少科研成果。翻译组学的研究方法包括RNC-seq（全长翻译组测序）、Ribo-seq（核糖体足迹测序）和Polysome profiling（多聚核糖体图谱）等。这里，我们主要介绍一下Ribo-seq——核糖体足迹测序。
Ribo-seq简介
核糖体保护的mRNA 片段可以免受RNA酶的降解作用。使用低浓度RNase处理核糖体-新生肽链复合物，降解掉没有核糖体覆盖的mRNA片段，可获得被核糖体保护的约22~30bp的RNA小片段，即核糖体足迹（ribosome footprints，RFP）。Ribo-seq通过对RFP进行测序，其可帮助我们得到核糖体分布的位置信息，并可帮助研究人员推测起始密码子位置以及uORFs等信息。
Ribo-seq研究思路
1. 表达量分析
我们时常会发现蛋白质丰度和RNA表达量的相关性并不理想，这时候，我们可以通过研究基因的翻译表达量从而解释这一现象。除此之外，当在转录水平发现过多或过少的差异基因，我们可以通过将翻译组和转录组的数据进行联合分析，优化目标基因的筛选范围；也可以通过与转录组进行共表达分析，找到符合预期表达模式的基因，再进行表达模式验证。
转录组和翻译组差异方向比较
表达量分析思路图
文献案例
PM2.5 promotes NSCLC carcinogenesis through translationally and transcriptionally activating DLAT-mediated glycolysis reprograming
PM2.5通过翻译和转录激活DLAT介导的糖酵解重编程来促进非小细胞肺癌（NSCLC）癌变
发表时间：2022年7月
发表期刊：J Exp Clin Cancer Res
影响因子：12.66
研究背景：PM2.5诱发癌症的分子机制仍不清楚。
研究目的：利用多组学技术和多种分子实验探讨PM2.5调节NSCLC癌变的机制。
研究结论：PM2.5增强eIF4E（真核生物翻译起始因子）的表达，从而增加糖酵解基因DLAT在多聚核糖体中的翻译，抑制NSCLC细胞凋亡。
样本类型：BEAS-2B细胞、A549细胞
技术类型：Ribo-seq、Polysome profiling、RNA-seq
技术路线：
主要研究结果：
该研究分析了正常人肺支气管上皮细胞（BEAS-2B）暴露于PM2.5后细胞翻译组及转录组表达谱的改变，发现PM2.5可诱导糖酵解代谢通路基因翻译效率上调，其中DLAT的TE升高最为显著。功能验证发现过表达DLAT促进NSCLC细胞的增殖和迁移，敲低DLAT则产生相反的效果。机制研究表明PM2.5分别通过两种不同的途径调控DLAT基因的表达。首先，PM2.5增强细胞真核翻译起始因子eIF4E的表达，从而增加DLAT在多聚核糖体中的翻译； 其次，PM2.5激活转录因子Sp1的表达，促进DLAT的转录。这些结果提示DLAT可作为NSCLC的一种诊断或预后的生物标志物和治疗靶点。
糖酵解代谢通路基因翻译效率上调，其中DLAT的翻译效率升高最为显著 （https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35869499/）
2. 调控分析
在表达量分析的基础上，可进一步研究导致翻译表达量发生显著变化的调控机制。据报道，常见影响翻译速率的因素有uORF（Upstream open reading frames）、miRNA和表观修饰。uORF是位于CDS上游5'UTR区域的开放阅读框，其普遍存在于真核生物的mRNAs中。翻译起始是mRNA翻译的限速步骤，uORF可通过调控翻译起始影响下游CDS的翻译。miRNA是一类小非编码RNA，其可通过mRNA转录后的抑制协调基因表达网络。已有研究发现miRNA会通过结合3’UTR序列并诱导脱腺苷酸化、去帽化和5’-3’降解，降低靶mRNA的翻译能力和稳定性。表观修饰，如m6A是真核mRNA最普遍的内部修饰，参与多种生理过程，可参与调节RNA的稳定性、转运、定位、翻译和RNA-蛋白相互作用来调控RNA的命运。已有大量研究发现m6A存在动态变化，会影响到mRNA的稳定性及翻译效率，进而影响蛋白质的产量。
mRNA的翻译调控示意图
调控分析思路图
文献案例
文献一
Targeting N6-methyladenosine reader YTHDF1 with siRNA boosts antitumor immunity in NASH-HCC by inhibiting EZH2-IL-6 axis
通过使用siRNA靶向N6-甲基腺苷阅读蛋白YTHDF1抑制EZH2-IL-6轴，增强NASH-HCC的抗肿瘤免疫
发表时间：2023年11月
发表期刊：Journal of Hepatology
影响因子：26.11
研究背景：NASH相关的肝癌（NASH-HCC）占肝癌患者的比例也越来越高。然而 NASH-HCC 的发生机制尚不清楚，临床还未有治疗NASH-HCC的药物或者其他生物疗法。
研究目的：探究NASH-HCC对ICB治疗耐药究的原因，寻找合适的治疗靶点。
研究结论：YTHDF1-EZH2-IL-6 信号轴可以募集和激活 MDSCs ，以致细胞毒性 CD8+ T细胞发生功能障碍，从而促进 NASH-HCC 的发生和发展。靶向YTHDF1可以提高NASH-HCC 抗anti-PD1免疫治疗应答新靶点。
样本类型：肝癌组织免疫细胞
技术类型：m6A-seq、RIP-seq、Ribo-seq、Western Blot
技术路线：
主要研究结果：
该研究发现NASH-HCC患者肿瘤组织中YTHDF1的表达水平相较于邻近正常组织显著升高。作者利用小鼠模型发现Ythdf1可以促进NASH-HCC的发生和发展。RNA-seq结果提示免疫系统受到Ythdf1的影响，sc-RNA seq和流式分析结果显示Ythdf1诱导髓源性抑制细胞（MDSCs）的积累并抑制细胞毒性CD8+T细胞的功能。进一步研究发现Ythdf1可诱导IL-6的分泌增加并且介导MDSCs的募集和激活，从而导致细胞毒性CD8+ T细胞发生功能障碍。作者联合m6A-seq、RIP-seq，Ribo-seq和蛋白质组等多组学研究，发现EZH2 mRNA是YTHDF1的关键下游靶点。YTHDF1 识别EZH2 mRNA上m6A修饰位点促进EZH2的翻译，EZH2进一步促进IL-6的表达和分泌。
NASH-HCC中YTHDF1通过EZH2上调IL-6 （https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37459919/）
文献二
Pervasive downstream RNA hairpins dynamically dictate start-codon selection
普遍存在的下游RNA发夹结构动态地决定起始密码子的选择
发表时间：2023年9月
发表期刊：Nature
影响因子：64.8
研究背景：真核生物基因的翻译受到mRNA中的结构特征调控，其中包括5'端前导序列中广泛存在的上游起始密码子(uAUGs) 。这些uAUGs可替代主要的AUG（mAUG）与翻译起始复合物结合，改变蛋白质合成的起始点，从而抑制下游mAUG的翻译。
研究目的：探究uAUG被识别从而调控下游蛋白翻译的机制。
研究结论：uAUG-ds介导起始复合物与uAUGs结合从而抑制下游mORF的翻译，抑制免疫蛋白的表达；
样本类型：拟南芥幼苗
技术类型：Ribo-seq、RNA-seq
技术路线：
主要研究结果：
作者对正常及elf18处理的拟南芥幼苗进行RNA-seq及Ribo-seq，分析得到13051个mAUGs上游5’UTR含有uAUGs的可表达转录物（含有uAUGs），并根据其翻译效率的变化分为TE-up、TE-nc和TE-down三组。为了鉴定uAUGs在翻译调控中的作用，作者又从这13051个转录物中筛选出翻译型uAUGs，发现翻译型uAUGs在TE-up组中显著富集，表明了uAUGs在调节免疫相关翻译中具有普遍作用。此外，作者还发现在对照组翻译型uAUGs的翻译起始率较高，而elf18处理后这种类型的uAUGs翻译起始率显著降低。由于uAUGs起始的翻译通常会抑制下游mORFs翻译，所以在elf18处理下uAUGs起始的翻译的减少也解除了对下游mORFs翻译的抑制作用。为了确定uAUGs影响翻译起始的机制，作者评估了转录本中的Kozak序列及RNA的二级结构，证实了双链RNA二级结构（mAUG-ds和uAUG-ds）影响翻译起始调控的可能性。之后，作者通过分析Ribo-seq数据，发现了TE-up转录物中elf18处理可以启动uORFs翻译起始到mORFs翻译起始的转变。总的来说，该研究发现了调控uAUG与起始复合物结合的翻译调控元件uAUG-ds，在正常生长条件下，uAUG-ds介导起始复合物与uAUGs结合从而抑制下游mORF的翻译，抑制免疫蛋白的表达；当植物处于免疫应答中，uAUG-ds被RNA解旋酶解螺旋，uAUGs不再与起始复合物结合，进而促进下游mORF的翻译，促进免疫蛋白的表达。
RNA在非典型起始密码子（uAUGs）下游的二级结构动态地调控翻译 （https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37674078/）
3. 编码能力分析
非编码RNA的编码能力研究一直是近年来的研究热点。而Ribo-seq技术由于可以检测正在翻译的RNA而常被用来进行sORF（小开放阅读框）可编码能力的预测。Ribo-seq是预测sORF编码能力的强大工具。首先，我们可以通过三碱基周期分析，判断该ORF是否具有翻译能力。核糖体的P位点是翻译过程中的肽链延伸位点，核糖体在该位点的停留时间最长，因此正在翻译的RNA的三碱基周期图呈现“高低低”的分布，而普通RNA则无此规律。其次，我们可基于检测分析工具如Ribo Taper、ORF Rater、ORF finder以及ORF score等指标来评估ORF的编码潜力。
三碱基周期分析
非编码RNA编码能力分析思路
文献案例
文献一
Developmental Dynamics of RNA Translation in the Human Brain
人大脑发育过程中RNA翻译的动态变化
发表时间：2022年10月
发表期刊：Nature Neuroscience
影响因子：25.0
研究背景：基因表达的精确调控是神经发育、可塑性和认知功能的基础。虽然已有研究描绘了发育中的人脑中的转录，但对这一过程中翻译调控的研究仍有空缺。
研究目的：深入探讨了人类大脑发育过程中RNA翻译的动态变化。
研究结论：绘制了人类大脑的翻译图谱，揭示了基因表达调控的关键节点，并识别了数千个之前未知的翻译事件，包括产生人类大脑特异性微肽的小开放阅读框（sORFs）。
样本类型：人大脑皮质样本、人脑组织、培养的hESC衍生神经元细胞
技术类型：Ribo-seq、RNA-seq、质谱
技术路线：
主要研究结果：
作者通过分析大脑皮质样本及大脑样本Ribo-seq数据中的三碱基周期，确认了活跃翻译的核糖体位置。共识别到172187个活跃翻译ORFs，映射到13305个基因。作者把接下来的研究集中于鉴定和分析sORFs上，其识别了来自8278个基因的38187个活跃sORFs，其中多个sORF来源于之前被注释为非编码的转录本。之后，作者将质谱数据与Ribo-seq结果进行匹配，在蛋白质水平上独立证实了这些sORFs的翻译。此外，作者还探讨了uORFs在调控典型ORFs翻译中的作用，发现某些uORFs与下游典型ORFs的翻译呈现负相关。通过对sORF进行序列分析，作者预测了微肽的理化特性，并探讨了它们的潜在生物学功能，发现这些sORF编码的微肽可能与RNA加工复合物相互作用，进而控制细胞核中mRNA剪接、翻译或DNA损伤反应。该研究揭示了人类大脑翻译组的复杂性，并指出了非典型ORFs在大脑发育和疾病中的潜在作用。为未来研究翻译调控在神经系统中的作用以及阐明许多新的人类大脑特异性微肽的功能提供了宝贵的资源和新的研究方向。
核糖体分析捕获人脑中的主动翻译 （https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36171426/）
文献二
The cardiac translational landscape reveals that micropeptides are new players involved in cardiomyocyte hypertrophy
心脏翻译图谱揭示短肽或导致心肌细胞肥大
发表时间：2021年7月
发表期刊： Molecular Therapy
影响因子：12.4
研究背景：心肌细胞肥大是心脏在生理或病理刺激后进行重构的主要代偿反应之一，其特征为由mRNA翻译介导的蛋白质合成增强。然而，这种诱导在翻译水平上的机制还未确定。目前尚不清楚蛋白质合成效率的提高是由于核糖体数量增加还是翻译速率增加。
研究目的：分析肥大心肌细胞中能被翻译的RNA分子、RNA翻译的规律及机制；
研究结论：将翻译组学和转录组学结合，发现了由lncRNA编码的多个影响心肌细胞肥大的功能性短肽。
样本类型：新生大鼠心肌细胞
技术类型：Ribo-seq、RNA-seq、Western Blot
技术路线：
主要研究结果：
为了研究心肌细胞肥大过程中如何在全基因组范围内调节翻译，作者分离了新生大鼠心肌细胞并用PE刺激24小时，然后，收获细胞并进行Ribo-seq和RNA-seq以检测心肌细胞肥大过程中蛋白质编码基因的核糖体占有率和转录组变化。发现，81.4% 的reads能比对到带注释的蛋白质编码基因的ORF，6.5%的reads比对到uORF，3.9%的reads比对到长链非编码RNA（lncRNA），表明这些lncRNA具有编码潜力。RNA-seq和Ribo-seq分析进一步证实了心肌肥大marker mRNA在心肌细胞肥大过程中表达和翻译增强，而且在PE诱导的肥大心肌细胞中，大多数mRNA翻译过程中的核糖体利用率没有显著变化。Ribo-seq数据的KEGG分析结果显示，核糖体是富集程度最高的，提示核糖体蛋白的合成在肥大心肌细胞中增强。进一步分析验证发现蛋白质合成增强是核糖体数量增加而非翻译速率上升导致的。之后，作者还在全基因组范围内鉴定新的sORF，作者将Ribo-seq reads与非编码转录本进行比对，发现了103个sORFs与已注释的lncRNA相匹配，作者随机选择了15个sORFs进行分析和表达验证，证实lncRNAs可以编码短肽。最后，作者通过过表达及RNA-seq测序分析，发现sORF8通过调节线粒体功能诱导心肌细胞的肥厚生长，而sORF6和sORF7短肽通过ERK信号通路调节心肌肥大。
肥厚型心肌细胞中活跃翻译的RNA片段检测 （https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33677093/）
总结
以上为Ribo-seq的常见研究思路汇总及文献案例。总的来说，翻译组研究可分为表达量分析、翻译调控分析、发现新的可翻译分子三个方向。表达量分析可以揭示关于细胞中活跃翻译的RNA片段定量信息，从而帮助研究者了解不同条件下的基因表达水平；翻译调控分析可帮助识别翻译速率变化，揭示翻译调控分子机制，包括起始密码子选择、翻译效率以及可能的翻译后调控；编码能力分析有助于发现新的mRNA剪接变体、非编码RNA或非传统的开放阅读框，揭示它们在特定生物学过程中起重要作用。
