1w字长文，慎点！历时一周呕心巨制。
2020年2月24日，加州大学伯克利分校的Janina Tamborski 和 Ksenia V. Krasileva教授在《Annual Review of Plant Biology》发表了题为"Evolution of Plant NLRs:From Natural History to Precise Modifications"的综述，这篇文章不仅对前人有关NLR发挥功能的潜在机制进行了概要，还对19年植物免疫领域有关NLR的重要工作(ZAR1抗病小体，TIR的NAD+酶活性)进行了点评，下面我将对该篇综述进行解读。
Abstract
NLRs(Nucleotide-binding leucine-rich repeat receptors)监测细胞内的植物环境，寻找病原体感染的迹象。几类NLR介导的免疫机制在多个物种间独立产生，包括NLRs功能性地分为sensors和helpers，在NLR亚家族中直接和间接识别机制的独立出现，小RNAs调节NLRs和NLRs网络的形成。了解NLRs的进化历史有助于了解病原体识别的起源和制约植物免疫系统的共同因素。设计抗病性的尝试很少，而且很少得到进化知识的支持。这篇综述中，我们讨论了NLR的进化，概述以往的设计抗病性方面的尝试，并提出如何使用进化知识，来推动未来对新出现的识别病原菌能力的研究。
1.Introduction
1.1植物免疫感知的胞内和胞外分支
NLRs(Nucleotide-binding leucine-rich repeat receptors):动植物和真菌的胞内免疫受体。
植物免疫受体监测细胞外和细胞内的区室，寻找病原体入侵的信号。大量定位于细胞膜上的受体，通常被称为病原菌识别受体(PRR)，监视细胞外空间，寻找入侵病原体的迹象。PRR识别危险信号，包括来自于MAMPS(microbe-associated molecular patterns)保守的分子模式，或DAMPS(damage-associated molecular patterns)的行为。识别危险信号后导致了典型的免疫响应的激活，包括但不仅仅包括活性氧的产生，胞内钙离子浓度增加，MAPK激酶的激活和防卫基因的表达。
细胞质的免疫受体识别外源分子，这些外源分子是由入侵的病原菌分泌到植物细胞内的，其中一些有酶的活性，对植物成分进行修饰。之所以称为核苷酸结合富亮氨酸重复受体(NLRs)，因为这两个核心区域(nucleotide-binding,leucine-rich repeat)在这些蛋白质中占多数。病原菌分泌的分子被称为效应子，它们的功能是通过抑制植物免疫反应来支持病原菌的入侵。NLRs对效应子的识别导致了与细胞外模式识别相同的一些反应，包括活性氧的积累、MAP激酶级联的激活和防御基因的表达;然而，这些反应的动力学不同于表面受体。此外，NLR的激活最终导致局部细胞死亡，称为超敏反应(hypersensitive response, HR)。
1.2NLRs是细胞内的免疫受体
NLRs有明显的结构域划分,由一个nucleotide-binding (NB-ARC)域和一系列的C端富亮氨酸重复(LRRs),和大多数包含N端的Toll/interleukin-1受体(TIR)结构域,一个卷曲螺旋结构域(CC),或不同的卷曲螺旋结构域(CCR)类似于抗白粉病的结构域(RPW8)。NLRs基于N端结构域形成了三类:TIR-NLRs(TNLs),CC-NLRs(CNLs),RPW8-NLRs(RNLs)(F1a)。总有一些NLRs是特例，例如，1.RBA1(RESPonSE TO THE BACTERIAL TYPE III EFFECTOR PROTEIN HOPBA1)只含有TIR结构域并且能识别细菌效应子HopBA1，只有TIR或RPW8的蛋白能凭借自己的力量对病原菌产生抗性。NLRs能直接结合并识别效应子或效应子发挥功能后间接识别其对植物成分的修饰。2.植物也有具有整合结构域(IDs)的免疫受体，这些结构域模拟病原菌的靶点，并在效应子的修饰下被激活。
NLR evolution and functions in flowering plants.png
简单图注：蓝字表示sensor，灰字表示helper。b中，圆圈代表效应子；被病原体靶向的植物蛋白，如图六边形所示；效应子的识别位点是三角形。图a注释有误，RPS4应该是helper
一般情况下，我们可以将NLRs分为两个功能组:直接/间接 sensor NLRs(涉及到入侵的识别)和helper NLRs(遗传上一些NLRs需要helper NLRs来进行免疫的激活)。在某些情况下，NLRs是由sensor和helper组成一对，成对地发挥功能，并且它们在遗传上是相连的。在一些物种中，helper NLRs被认为从单对NLRs出现，然后在扩展到许多NLRs的复杂网络，如NRC基因家族(NLR REQUIRED FOR CELL DEATH)，在从点状分布开始扩展，并作为许多sensor CNLs的helper。在sensor NLRs下游起作用并对抗病性和细胞死亡都起作用的RNL helpers包括ACTIVATED DISEASE RESISTANCE 1(ADR1)和N REQUIREMENT GENE1 (NRG1)。
1.3 NLR激活的机制
Effector:来源于病原菌的分子转移到植物细胞中，改变其环境，使之有利于病原菌侵染。
NB-ARC：NLRs的核苷酸结合结构域起分子开关的作用，促进活性受体复合物的寡聚化。
Leucine-rich repeats(LRRs):结构域形成马蹄形结构，促进蛋白质-蛋白质相互作用。
Toll/interleukin-like receptor (TIR)domain:自身或作为NLRs的一部分能诱导HR。
Coiled-coil (CC)helix bundle:促进信号台的形成;可以自发诱导HR。
RESISTANCE TO POWDERY MILDEW 8 (RPW8):自发发挥功能或作为NLRs的一部分，类似于真菌引起气孔的毒素.。
TNL:N端有TIR信号结构域的NLR。
CNL:N端有CC信号结构域的NLR。
RNL:N端有RPW8信号结构域的NLR。
Integrated domain(ID):整合到NLR的一类非经典结构域，拥有独特的进化历史。
Sensor:负责结合效应子或识别效应子活动的NLR。
Helper:被另一NLR激活或识别到效应子后引起下游信号级联的一类NLR。
Resistosome:在受到激活时组装成由NLRs组成的轮状寡聚物结构。
Guardee:一种植物蛋白，由NLR看守，监测效应子修改植物细胞的信号。（？？？谁检测,NLR,还是guardee）
sensor NLRs及其helper激活的分子机制可能存在显著差异，目前尚不完全清楚。然而，它们共有的结构域和共同的进化起源表明，在ATP与ADP交换后通过NB-ARC结构域进行的多聚化是NLR激活的关键步骤。因此，NLRs常被称为免疫信号中的分子开关。结合ADP的状态被认为是off状态，在这种状态下LRR与NB-ARC域相关联，从而稳定了NLR处于非激活状态。NLRs的激活通常与ATP的结合状态相关，称为on状态。
一种间接sensor蛋白的冷冻电镜结构，Arabidopsis thaliana HOPZACTIVATED RESISTANCE 1(ZAR1)，已经证明了这两种状态，并提出存在第三种中间状态。这些结构表明ADP结合形式是单分子的，在LRR和NB-ARC之间有多个分子内接触点。通过LRR识别 效应子引起的guardees改变进而改变了NLR的蛋白构象，从而解除了NLR的非激活状态。ATP的加入诱导了一种寡聚体状态，并形成了一种叫做抗病小体的轮状五聚体，让人联想起代表Apaf-1激活状态的哺乳动物凋亡小体和哺乳动物NLRs激活后组装的炎症小体。ZAR1的CC端通过形成一个α螺旋管促进了ZAR1的寡聚化。活性复合物与质膜结合，漏斗内的带电残基是引发细胞死亡和抗病所需的。
配体结合或修饰如何影响NB-ARC结构域的核苷酸状态需要进一步阐明。基于大量研究的观察，一种可能性是效应子的结合导致了NLR分子内构象的改变，使NB-ARC结构域得以暴露，从而促进了ADP与ATP的交换。这也是ZAR1的情况，其中尿苷化的宿主蛋白激酶PBS1-LIKE2(PBL2)结合到ZAR1/RKS1(RESISTANCE-RELATED KINASE 1)复合物导致了NB-ARC相对于其他区域的旋转，并失去了与ADP的亲和力。然而，在另一种模型中，即基于平衡的开关模型中，病原物效应子对ADP结合状态的NLR没有明显的亲和力。在该模型中，NLRs在开启和关闭状态之间的持续循环，病原菌效应子稳定了开启状态，使平衡向开启状态转移，从而导致防御反应的激活。这两种模型可能共存，并被不同的NLRs使用。允许不同的激活模式存在不仅可以使免疫反应更强有力的抵御病原体的干扰，还可以适应效应子不同的结合亲和力。
迄今为止，没有活性TNL复合物的结构的报道;然而，合理的想法是，假设他们会基于NB-ARC结构域的寡聚化，从而形成一个类似的轮状结构。TNL被认为可以形成寡聚物，TIR结构域可以在多个表面上自发结合。激活的ZAR1抗病小体通过其N端α螺旋与质膜联系,而激活的TNL复合物可能通过TIR结构域酶解的NAD +来传递信号。多个植物TIRs，也包括来自哺乳动物SARM1(STERILE ALPHA AND TIR MOTIF ConTAINING 1)的TIR，能够将NAD+切割成NAD和cADPR(cyclic ADP-ribose);然而一些植物TIR产生除这两种以外的另一种产物,v-cADPR。动植物中TIR的酶活性都需要自发结合，并依赖于保守谷氨酸残基的催化活性。
NLRs激活后引发下游反应，最终导致HR，一种局部细胞死亡的形式。迄今为止，所有的TNLs都被发现通过信号传递并严格需要EDS1(ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY1)和PAD4(PHYTOALEXIN DEFICIENT 4)编码的脂肪酶，TIR结构域的酶解产物如何影响下游信号元件仍然未知。最近的研究极大地加深了我们对RNLs如何在sensor NLRs下游起作用的理解。新数据表明，NRG1与EDS1、SAG101(SENESCENCE-ASSOCIATED GENE 101)相互作用，形成该复合物来起始拟南芥中HR反应。这种复合物可能直接导致HR，因为NRG1的RPW8结构域让人联想到成孔毒素，它可能会插入质膜从而破坏膜的完整性。有些CNLs在遗传上依赖NDR1(NON-RACE SPECIFIC DISEASE RESISTANCE 1),这是一种固定在质膜上的蛋白质。由于ZAR1的激活状态的抗病小体与细胞膜相关，因此，NDR1可能是细胞穿孔所必需的。总的来说，这些研究使我们更近一步理解HR的启动和功能，这是更好地理解NLR介导免疫的关键一步。
在接下来的章节中，我们将讨论产生各种NLRs的不同进化过程，说明系统发育和进化分析如何指示NLRs的激活模式，并解释我们如何将这些知识应用于设计新的抗病性中去。
2.NLR进化的基因组学基础
2.1 NLR在被子植物中的进化
通过对100多个已测序的植物基因组的分析，我们发现了NLR进化的一些常见模式，而这些模式在单个物种或植物家族的研究中并不明显。TNLs、CNLs和RNLs在其NB-ARC系统发育的基础上形成了三个单系群，并具有独特的N端结构域，这可能说明祖先将N端不同的结构域(TIR、CC和CCR)融合到原始的NB-ARC结构域上(F1a)。所有这三种NLR类型都出现在基础植物谱系Amborella(无油樟属)中，这表明该分支在远古时期就是拆开的。22个代表性被子植物的NLRs祖先重建结果表明，一个基底植物大约有23组NLRs。对75个植物基因组的20571个NLRs的同源分析表明，在311个NLR家族中，只有38个NLR家族在单双子叶植物中都是保守的，而其余的家族则在不同的种系进行扩展。
RNLs、TNLs和CNLs的拷贝数因植物种类而异(F1a)。除了在裸子植物(在云杉中有31个ADR(一种RNL helper)同源基因)外，RNLs通常以低拷贝数为特征。RNLs表现出显著的内含子保守性，Amborella(无油樟属)和双子叶植物共用4个内含子，而单子叶植物共用3个内含子(第二个内含子丢失了)。NRG和ADR的分离早于被子植物的分化，它们在开花植物中的线性区段仍然是保守的。NRG基因，而不是ADR基因，在一些谱系中已经丢失。
TNLs形成两个亚家族，TIR1和TIR2，只有TIR2类NLRs保留在单子叶植物中。TIR1 NLRs在许多双子叶植物中保留，但在某些双子叶植物谱系中缺失。在所有开花植物中，TNLs表现出显著的内含子/外显子连接的保守性:第一个内含子将TIR从NB-ARC中分离出来，第二个内含子将NB-ARC从LRRs中分离出来，第三个内含子将第一个LRR基因从其余的蛋白质中分离出来。相比之下,CNLs不共享保守的内含子，目前的数据表明，祖先的CNLs是无内含子的，CNLs中的内含子可能是后期进化获得的。
根据在大的进化距离上保守的氨基酸基序，CNLs被细分为至少四个不同的组。单双子叶植物共有的两组包含一个EDVID motif，如拟南芥中的ZAR1和RPM1蛋白，马铃薯中的Rx蛋白和禾本科中的Sr33/MLA蛋白。一些CNLs在第一个α螺旋内还包含一个功能性保守的N端蛋氨酸,丙氨酸,天冬氨酸,丙氨酸(MADA)motif,在寡聚化后进行重排并且介导了其锚定在膜上。
在NLRs的全球进化史的背景下(F1a)，很明显，sensor和helper角色进化了多次。NRC helper在1亿多年前石竹目和菊科分裂之前就就已存在，并在茄科中得到扩展；而 RNL helper则更古老，可以追溯到裸子植物和被子植物分裂之前。相似的是，成对的NLRs，如RRS1/RPS4(RESISTANT TO RALSTonIA SOLANACEARUM 1/RESISTANT TO PSEUDOMonAS SYRINGAE 4)和RGA4/RGA5(R-GENE ANALOG 4/R-GENE ANALOG 5)是并行进化的的(F1a)。Sensor RPS2(RESISTANT TO PSEUDOMonAS SYRINGAE 2)和RPM1(RESISTANCE TO PSEUDOMonAS SYRINGAE PV. MACULICOLA 1)保护相同的植物蛋白RIN4(RPM1-INTERACTING PROTEIN 4),但至少在单子叶植物和双子叶植物分开之前就已经分开了，这表明它们的功能可能是独立产生的。类似地，编码可以直接结合并识别同一病原菌的基因并不在一个基因簇里面，如RPP13和RPP1(RECOGNITION OF PERonOSPORA PARASITICA)。这一发现证明了两种功能相似的NLRs不一定是一并进化来的。
2.2 特定谱系的分支扩张及收缩
在植物基因组中，NLRs的数量有100倍的变化，从木瓜、猕猴桃、黄瓜和西瓜中的几十个到六倍体小麦中的几千个。即使是亲缘关系很近的物种也会表现特定谱系的扩张和收缩。虽然驱动NLR扩张和收缩的选择机制仍然难以捉摸，但它们可以反映植物的生活方式，并受到来自环境的选择压力的影响。与NLR历史相关的植物生活方式包括水生环境和雌雄异株(猕猴桃，木瓜)或有单独的雄花和雌花(玉米，黄瓜)。NLR库的群体遗传学研究表明，环境压力影响了单个物种内NLR的多样性，例如野生番茄和拟南芥对病原菌的适应，并可能导致多态性的长期维持。
如何在较短的进化时间内实现NLRs的扩展或收缩？茄科和禾本科的CNL爆发性增长，部分原因是长末端重复(LTR)逆转录转座子的活动。NLRs本身的重复特性也有助于它们的进化，利用重组进行基因转换和利用复制机制进行局部复制。
2.3 NLR等位基因的多样性和新基因融合
即使在亲缘关系较近的物种中也能观察到NLR基因的扩张和收缩;然而，单靠基因复制不足以产生新的病原菌识别。在所谓的生与死模型中提出的NLR快速进化在今天仍然适用。目前的基因组数据集支持通过基因内和基因间重组和基因转换产生嵌合LRRs、以及LRRs表面暴露区域的点突变，来支持NLRs的多样化。这种NLRs能够识别高度可变甚至结构上不相关的效应子，很可能是通过直接结合机制实现的，并且能够产生抵抗多种病原菌的抗性。具有等位基因变异频率高的NLRs可以出现在TNL或CNL分支中，这一类NLRs并不是单系的。
最近，带IDs(Intergrated domain)的NLR展现了新的识别特性。禾本科的一个特殊的NLR-ID分枝， MIC1(major integration clade 1)，持续变换IDs的位置，从而促进新ID sensor的产生。NLR-IDs显示了复制和染色体内易位的证据，但确切的结构域整合进基因组的机制目前仍不清楚。对小麦NLR-ID的分析表明，一旦ID整合到基因组的NLR附近，选择性剪接就会产生融合的转录本。
快速产生新的识别特异性的代价是:自身免疫。在拟南芥中，几个NLRs的等位基因变异与自身免疫有关，这表明NLRs与其守卫(guardees)可能不匹配。拟南芥NLR RPP7的等位基因变异最近被证明，当与RPW8的不兼容等位基因结合时会引起自身免疫反应。人们可能会推测，高度自交系作物(如玉米)基因组中低数量的NLRs是由自身免疫造成的，因为自身免疫会导致不匹配NLRs丢失。【这一部分我的理解是玉米转座子多，也就容易产生NLR的变体，进而产生自身免疫，进化中导致了这类NLR丢失，进而基因组中NLR的数量低】
2.4 sensor和helper NLRs中的功能网络
Flor最初的有关R基因与效应子识别中的“基因对基因”假说进化为包括sensors和helpers功能性网络的新的范例。RPS2和RPM1是sensor NLRs的经典例子，它们可以通过保护效应子靶点的中心蛋白RIN4来追踪多个效应子。其他NLRs如ZAR1监测多个旁系同源的guardees，每个旁系同源的guardee跟踪一个不同的效应子。带有完整的WRKY结构域编码NLR-ID的RRS1的等位基因可以检测到至少两个效应子，AvrRps4和PopP2 ，并且RRS1/RPS4这对组合可以抵抗三种不同的病原菌。虽然一个NLR可以识别多个效应子，但独立进化的NLRs也可以识别同一效应子。在大豆和拟南芥中，RIN4分别受到进化上不相关的NLRs Rpg1b/Rpg1r和RPM1/RPS2的保护，这表明对假单胞菌效应子AvrRpm1和AvrB的识别是独立进化的。另一种假单胞菌效应子，有蛋白酶活性的AvrPphB，对它的识别在拟南芥和大麦中至少进化了两次，通过NLRs保护同一靶点，PBS1(AVRPPHB SUSCEPTIBLE 1)。最后，直系同源NLRs，如MLA/Sr33/Sr50和Rx1/Gpa2，通过等位基因变异进化出对不同效应子的识别。总之，这些研究表明，sensor NLR的识别特异性不能仅仅基于一级序列的相同来确定。
Helper NLRs可以形成自己的功能网络。在拟南芥中，TNLs和CNLs可以通过NRG1和ADR1亚支的蛋白进行信号传递，其中TNLs对NRGs表现出更强的偏好，而CNLs对ADRs表现出更强的偏好。NRC helper 分枝代表了一个更新的网络，也支持一个紧密相关的CNL sensor 分枝。虽然配对的NLR基因(如RGA4/RGA5和RRS1/RPS4)的蛋白质产物也显示出物理相互作用，但迄今为止，NLRs对NRC和RNL的功能依赖仅在遗传学上表现出来。蛋白质与蛋白质的相互作用是否是成对的NLRs所特有的，是否在helper网络的形成过程中已经丢失，这仍有待确定。
NLR生物学中趋同进化的模式
3.1在NLR进化过程中，sensors对helpers的依赖不止一次出现
在在单双子叶植物中，RNL分支是一个古老而保守的helper群，而NRCs的helper的功能是独立产生的(F2a)。NRC很可能是在1亿多年前从一对茄科的NLR演化而来，并从那以后演化成一个由helper和sensor组成的功能性网络。
Patterns of convergent evolution in NLR biology.png
甚至最近，两个独立的分支TNLs和CNLs，在禾本科和十字花科中被细分为sensors和helpers，以RRS1/RPS4和RGA5/RGA4为代表(F2a)。有趣的是，禾本科和十字花科编码sensor和helper配对的基因在基因上是头对头定向连接的，sensor通常带有一个ID(图2aii，此处原文注释也有问题)。基因组和进化机制（如，驱动基因对头对头的方向的聚合，融合IDs，或功能细分成helpers和sensors）目前还不知道。
sensor免疫受体对附加受体的依赖并不是植物独有的。在动物NLR家族中，NAIP5(APOPTOSIS INHIBITORY PROTEIN 5)是一种结合鞭毛蛋白的sensor，并且它依赖于helper NLR 家族NLRC4 (CASPASE ACTIVATION AND RECRUITMENTDOMAIN- ConTAINING 4)来执行响应。即使在NLR家族之外，像 FLS2(FLAGELLIN SENSING 2)和BRI1(BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1)这样的结合配体的受体激酶在功能上作为一种sensor，依赖于与共受体BAK1(BRI1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE 1)的物理相互作用来进行复杂的激活和下游信号传导。因此，配体感应受体需要一个额外的伴侣是一个普遍的进化主题。重要的是要了解这样的要求是否是受体启动信号级联的共同功能约束强加的，还是由于额外的调节水平导致的(受体共受体协同发挥作用)【这句话翻译的绕口的很，请忽略】。
3.2 小RNA对NLRs的调节
对NLRs的不当调节代价高昂;因此，NLRs在mRNA和蛋白质水平上都受到严格的调控。对植物基因组中的NLRs进行的整体分析揭示了一个共同的模式：NLRs能够被miRNAs调节，并且miRNAs能够从重复的NLRs产生(F2b)。一些miRNAs，如靶向CNLs的miR482/2118，很早以前就出现了;这些miRNA家族在大多数植物谱系中都是保守的，并且靶向NB-ARC区域保守P-loop区域。其他的miRNAs是最近出现的，并且具有谱系特异性的。新的miRNAs的持续进化与NLRs谱系特异性的扩增有关，新的miRNAs可能来自于目标NLR序列的倒置复制。
miRNAs对NLRs的调控与小rna (sRNAs)对快速增殖的遗传元件(转座子(TEs))调控相似。NLRs和TEs都能快速复制，表现出谱系特异性的扩张和收缩，并能在基因组中跳跃。无论是新插入的TEs，还是最近复制的基因，都受到由sRNAs介导的RNA依赖的DNA甲基化(RdDM)来调控的表观遗传标记。在丁香假单胞菌侵染中，对sRNAs和拟南芥表观遗传标记的改变的整体分析发现，无论是TEs还是NLRs均在感染早期被释放，并开始产生sRNAs，这些sRNAs中有许多映射到NLR和TE位点。虽然在侵染过程的后期，通过RNA介导向的DNA甲基化(RdDM)在基因组位点沉积新的DNA甲基化可以使TEs沉默，但是许多NLRs可以继续表达，尽管靶向它们的sRNAs仍然存在，如ADR1。
在启动子元件中插入TEs对NLRs的协同调节具有重要的功能作用(图2b)。在水稻中，在NLR基因pigmS的启动子中插入一个微型的反向重复转座元件，可以限制其在花粉的表达，并通过RdDM沉默pigmS在其他植物组织中的转录。从功能上讲，PigmS蛋白是另一种NLR (PigmR)的显性抑制因子，pigmR对稻瘟菌具有抗性。当PigmS沉默时，PigmR蛋白是活跃的，并在营养器官中提供抗性;然而，在花粉中，它被PigmS所抑制，因此减少了在水稻籽粒中激活免疫信号造成的产量损失。更好地理解sRNAs对NLR的调控和可逆的表观遗传标记，可以为设计平衡免疫激活和产量损失的NLR启动子提供新的策略。
3.3 与哺乳动物内在免疫的相似性
普遍的NLR特征的独立进化不仅在植物谱系中是明显的，而且在生物界中也是明显的。在动物中，一个关系遥远的NB-ARC结构域的同系物，NACHT，独立地与LRRs和不同的信号结构域[CARD(CASPASE ACTIVATION AND RECUITMENT DOMAIN),BIR(BACILLOVIRUS INHIBITOR OF APOPTOSIS PROTEIN REPEAT),PYD(PROTEIN PYRIN DOMAIN),DD(DEATH DOMAIN),DED(DEATH EFFECTOR DOMAIN)]结合。哺乳动物NLRs具有类似的细胞内监视功能，可在感知到病原体或自身免疫发生时会诱导细胞死亡。在真菌中，含有NACHT域的蛋白质Het-E触发非自我识别并诱导细胞死亡，称为异核体不亲和性。有趣的是，真菌HeLo结构域具有与RNLs中RPW8类似的四螺旋束折叠结构，可以将自己插入膜中，从而形成一个孔洞，诱导细胞死亡。
最近在植物NLRs结构生物学方面的一个突破是解决了ZAR1及其守卫RKS1和PBL2激酶活性寡聚复合体的结构。ZAR1抗病小体在结构上类似于Apaf-1的凋亡小体和哺乳动物NLRs的炎症小体(F2c)。虽然炎症小体和抗病小体之间的结构相似性很明显，但仍有许多问题没有得到解答。
首先，CNLs的CC结构域是否足以在细胞膜上形成一个孔并导致细胞死亡，还是需要额外的因素？RNLs和它们的RPW8结构域，足以在膜上形成一个孔，这与真菌HeLo蛋白结构相似，是显而易见的(诱导细胞死亡的)候选者。
第二，是否所有的sensor都形成均匀的抗病小体，或者抗病小体的组成是否变化？例如，是等比例配对的helper和sensor，还是单个sensor启动多个helper的复合物形成(F2c)？后者是哺乳动物的情况，比如NAIP5和NLRC4。单个NAIP5 sensor被鞭毛蛋白感知激活，在构象改变后，与它的helper NLRC4结合，进一步诱导NLRC4-NLRC4寡聚物形成。最后的炎症小体形成一个开放环结构，具有1个NAIP5 sensor和9个NLRC4 helper。虽然ZAR1抗病小体是均质的【这里我的理解是自身形成五聚体，而不与其他蛋白共同形成，如helper】，但我们不能排除其他植物NLRs形成类似NAIP5/NLRC4的异质蛋白复合物的可能性。CCs可以形成由复杂的相互作用网络组成的同质和异质寡聚物，这支持了异质抗病小体的概念(F2c)。虽然CNLs通常形成异质寡聚体，但TNL异寡聚体的报道相对较少，目前仅限于成对的NLRs。这将是令人兴奋的，看看配对的NLR抗病小体的组成是否新颖，是否有等比例的sensor和helper(F3c)。
植物和哺乳动物执行细胞死亡的相似性超越了抗病小体到炎症小体的结构相似性。最近关于细菌、哺乳动物和植物TIR结构域NADase活性的报道揭示了细胞死亡的激活可以通过保守的第二信使介导。结构分析显示，哺乳动物神经细胞死亡的执行蛋白SARM1和植物TIRs的TIR结构域存在保守的底物结合位点。与跨界TIR蛋白的共同功能相一致，在本生烟中表达SARM1的TIR结构域产生了在视觉上与HR难以区分的细胞死亡反应。SARM1和TNLs主要的区别是它们的遗传需求不同。与植物TIRs不同的是，SARM1能够独立于EDS1和NRG1诱导植物细胞死亡。对最终导致细胞死亡反应的精确信号级联的阐明可以进一步揭示不同物种间的相似性，并阐明EDS1和NRG1的植物特异性作用。
最后，所得到的抗病小体结构是否代表了其功能活性状态？对哺乳动物NLRs的研究表明，炎症小体形成后，激活的caspase结构域可能被蛋白酶介导释放。因为它已被广泛证明在植物N端截短的NLRs，如TIRs或CCs足以诱导细胞死亡,有可能活性的抗病小体在植物细胞中进一步被修改，进而诱发HR反应。
Evolutioneer’s guide to engineering novel disease resistance-1.png
Evolutioneer’s guide to engineering novel disease resistance-2.png
我们能从观察到的常见NLR进化模式中学到什么？其中一个主要的实际结果是，有多种方式进化为相同的功能，新功能也可以以多种方式设计。这些功能的设计可以通过学习NLR生物学的一般原理来指导。
4.基因工程改造NLR等位基因当前的进展
4.1 NLR嵌合体定义了效应子结合区域，并允许在等位基因NLRs之间进行识别转移
亚麻NLRs嵌合体是首次改变NLRs识别效应子的一次成功尝试。本研究分析了亚麻抗锈病基因L (L, L1-L11, LH)的13个等位基因，以确定变异区域。他们随后创造了L2、L6和L10的嵌合体;然后转入亚麻;并对亚麻锈病易感性的变化进行了筛选。NLRs之间交换的区域包含880个氨基酸，包括整个LRR区域。表达这些嵌合体的转基因亚麻植株表现出与LRR相关的抗性和易感性表型;也就是说，含有L6- TIR-NBARC和L2 - LRR的嵌合基因L6-L2表现出了L2等位基因的抗病表型。这一发现表明，LRR区域可以充分调节NLRs的识别特异性，直接与它们所识别的效应子相互作用。自从第一次在L中进行LRR交换以来，其他几个直接结合物【我觉得这里是NLR直接识别effector】中的识别特异性由LRR区域决定。这已经通过等位基因交换或在体内的相互作用得到证明。
4.2在植物蛋白中引入新的效应子底物序列
NLRs可以直接与效应子结合或通过监测宿主蛋白(i.e.a guardee)来识别效应子(图1b)。由于我们对效应子功能的理解在不断提高，利用效应子活动来设计抗性似乎是一个很好的解决方案。Kim使用这一策略来设计RPS5的guardee，使得RPS5能识别更多的效应子。RPS5识别细菌效应子AvrPphB的活动，AvrPphB作为蛋白酶作用于PBS1和相关的受体类胞质激酶(RLCKs)。当AvrPphB破坏植物中这类蛋白后，这些RLCKs发生构象变化，这种构象变化被RPS5识别并导致免疫反应的激活。在感病型的拟南芥中将PBS1的蛋白水解位点换成另一效应子AvrRpt2的蛋白水解位点，极大地提高了其对丁香假单胞菌的抗性。同样的策略也被用于将烟草腐蚀病毒的病毒蛋白酶NIa的蛋白水解位点插入到PBS1中。尽管这种方法在本氏烟中导致了NIa切割PBS1和HR反应，但这种操作只增强了烟草对病毒的部分抗病性。这一发现表明，底物切割率和信号强度需要足够强才能引起强有力的响应，并可能对不同的效应子有不同的要求。因此，在某些情况下，这种方法可能需要额外的优化和蛋白质工程来产生抗病性。
4.3引入氨基酸变化来修改效应子识别特异性
LRR可作为效应子结合位点和介导NLR识别特异性促使许多人尝试产生随机突变的LRRs以产生新的抗病性。NLR Rx能够对其外壳蛋白残基T(ser)121和K(lys)127 (CP- TK)发生变化的突变体马铃薯病毒x产生抗性。在这两个位置分别带有赖氨酸和精氨酸的CPs(CP-KR)不能被Rx识别【上面这段话也就说明Rx不能识别CP-TK和CP-KR】。在一项研究中，利用容易出错的PCR，对Rx进行随机突变，筛选出数千个突变体，期望得到识别CP-KR的突变体。这种方法产生了几个Rx突变体蛋白，该Rx突变体蛋白对携带CP-KR和CP-TK的马铃薯病毒x，以及另一种相关病毒——杨树花叶病毒，展示出抗性。虽然这种方法扩大了对Rx的认识，但并没有产生新的抗病性【这里新的抗病性没有产生我的理解是还是抗同一病原菌，不过是扩大了小种范围】。
2014年发表的两项研究通过随机诱变、基因转移和定点诱变等手段，扩大了野生马铃薯(Solanum demissum) NLR R3a的识别能力。野生型R3a可以识别Phytophthora infestans的效应子Avr3aKI，而不是等位基因变体Avr3aEM，它(Avr3aEM)已经成为现代Phytophthora(病)中流行的等位基因，很可能是由于Avr3aEM逃避了R3a介导的抗性后通过正向选择被保留了下来。Segretin等人鉴定了八种R3a单氨基酸替换突变体，在响应AvrR3aEM时，它们能够触发本氏烟中的HR反应。其中6个突变位于LRR区域，1个位于NB-ARC, 1个位于CC。Chapman等人在经过几轮人工进化后，发现了几个与WT相比，对细胞死亡反应更强烈突变体。然而，这些被改造的NLRs，被称为R3a+和R3a*，对携带Avr3aEM的P. infestans菌株并没有增强的抗性。
在一项后续研究中，Segretin和同事将发现的突变转移到R3a在番茄的同源基因I2中，看看获得的功能突变是否可以在同源基因之间转移。I2通过识别Avr2，对番茄镰刀菌产生抗性，I2与R3a序列相似度高。R3a+等位基因中的两个残基(I141F和N336Y)在I2中保守，在I2中进行突变以便于查看其识别能力是否会扩大。然而，I2中发生这些氨基酸改变会导致识别能力的丧失或自发活动。假设同源NLRs中的这两个位点可能是NLR敏感化的关键，为了验证这个假设，Giannakopoulou将两个残基突变为所有可能的其他氨基酸。鉴定到了I2I141N，它可以识别Avr3aKI和Avr3aEM，以及两个新的Avr2变种。在本氏烟中表达这些NLRs导致了其对携带任一Avr3a变种的P. infestans的部分抗性。因此，迄今为止，试图随机诱变NLRs并没有导致新的抗病能力的产生。
5.工程改造NLRs的前景和挑战
5.1设计在面对效应子活动时激活NLR的guardees
利用效应子的活性来设计新的抗病性是一种很有前途的策略，因为病原菌效应子往往在进化过程中避开NLR的结合，同时保持其活性。有几种方法可以利用效应子的活性来避开病原体的危害。这包括Kim等人采用的策略，将已知的效应子靶向的蛋白水解位点转移到由植物NLR保护的植物蛋白上。我们也许可以这样设计一个guardee，它经过几个效应子的修饰后可以激活NLR(图3a)。单一防卫的NLR可以识别多少种不同类型的效应子活动呢？RIN4被几种NLRs(包括RPS2和RPM1)保护，并被几种具有不同酶活性的效应子靶向，这表明NLRs的间接识别实际上只能识别一种修饰，因为RPM1只有在RIN4被磷酸化后才被激活，而RPS2可以识别RIN4的溶蛋白性裂解。RIN4被几个NLRs保护，这一事实使得它成为引入更多效应子靶点的有吸引力的候选。效应子酶活性的研究将继续扩大这一方法的潜在靶点。通过选择对病原体入侵至关重要的效应子，我们可以尝试创造持久的抗性。这种方法需要对效应子活动有全面的了解。因此，理解天然效应子的靶点及其活动对这种改造方法至关重要，并将极大地提高我们对创造新的识别能力的认识。
5.2 改造NLRs，使其带有新的整合结构域(Integrated Domains)
除了修改guardees之外，我们还可以使用IDs来设计NLR分支。理想情况下，我们可以使用现有的NLR-IDs作为平台，利用效应子相互作用研究中确定的目标来创建融合(图3b)。实际上，我们今天所观察到的NLR-IDs具有自最初的融合事件以来已经共同进化了数百万年的结构域。因此，这种工程方法将需要仔细解剖共进化区域或鉴定多面手的NLR，这种NLR仍然可以接受新的可变结构域融合，如在禾本科鉴定的来自MIC1的NLRs。它还需要更好地理解NLR-ID激活机制。如，效应子对ID的修改如何改变NLR-ID的构象?helper NLR在这一对组合(NLR和effector)中的角色是什么？针对不同的NLR配对情况提出了对比模型;一种观点认为helper抑制了sensor NLR的自发活动，而另一种观点认为helper介导了免疫信号的启动。提高我们对成对NLRs的认识将促进对新NLR-ID融合蛋白免疫激活响应的精细调节。
在水稻Pik基因的等位基因序列中，整合的 HMA结构域(heavy-metal-associated)是NLR中最具多态性的区域，强烈提示它是效应子的结合界面。Pik等位基因及其相应的效应子的晶体结构证实了这一观点。使用效应子结合到ID的一个合理的下一步是交换效应子靶向的其他已知宿主结构域的IDs(图3b)。这样的交换将使效应子的识别成为可能，效应子的功能仍然难以实现，但是通过将效应子引入到现有的NLR-ID支架中，效应子的靶点已经被鉴定(图3b)。除了创造新的融合蛋白外，现有的IDs蛋白工程可以改变NLR和效应子之间的结合强度，从而提高现有的识别能力。为此，从与几个等位效应相关的NLRs晶体结构中获得知识，如康塞普西翁所做的那样，提高了我们对结合界面的理解，以及需要改变哪些氨基酸来增加结合亲和力。这些信息将有助于指导设计工作，以超越过去使用的随机诱变方法。
5.3 利用具有自然多样性的LRR结合特异性的NLRs
效应子与NLR相互作用的最简单模式是通过可变的LRR区域直接结合，因为它涉及的遗传成分最少。因此，(设计效应子)直接结合的NLRs可能是最容易设计的NLRs类型(图3c)。然而，我们目前缺乏这些相互作用的结构和生化数据。关键的未解决的问题包括决定结合特异性的LRR残基是哪些、产生相互作用所需的典型亲和力是哪些以及引发免疫信号激活的结构重排是什么。为了克服这一局限性，我们可以在前面讨论过的亚麻L基因等位基因序列的基础上进行研究，并通过自然等位基因多样性和结构建模来一致地鉴定LRRs中的结合部位。通过对NLRs种内自然多样性的采样，我们旨在查明在一个LRR中的10-20个残基，这些残基是最易变的，因此很可能参与效应子的结合。这类残基集将允许有针对性的工程改造，要么改进现有的结合特异性，要么推出新的结合特性。
6. 结论和未来方向
了解NLRs的进化对于确定其功能、了解环境压力对植物免疫受体库的影响以及设计新的识别特异性至关重要。现在很清楚的是，我们不能将对一种NLR的认识应用于另一种NLR。然而，NLRs的系统发育位置可能表明它们是更有可能成为helper(如RNLs)还是sensor，以及它们依赖于哪种helper(如sensor 的NRC-dependent 分支) 。此外，IDs不仅突出了可能被病原体靶向的植物蛋白，从而受到植物免疫系统的监测，而且还为效应子导向的工程方法提供了前所未有的潜力。然而，重要的是要记住，即使在一个分支的基因之间也可能存在功能差异，就像十字花科和茄科的NRG1表现一样。随着序列数据库的发展，我们将能够提出关于NLR进化的越来越有挑战性的问题，并找到以前被噪声掩盖的常规模式【这里的噪声我觉得是技术受限】。
NLRs的改造已经证明是困难的，成功的报告仍然是有限的。根据我们目前对NLRs的了解，有三种主要的策略来创建新的抗病性。新近获得的群体内NLRs序列多样性为预测效应子结合的表面提供了原材料。对于NLR-IDs，很明显，IDs有可能成为效应子靶向的目标平台。我们现在需要了解融合的时间以及随后与经典的NLR结构域的共同进化。此信息将通知选择可用于交换ID的支架NLR。例如，来自进化最年轻的分支MIC1的NLR-IDs可能拥有被成功改造的最大潜力。在不久的将来，从NLR进化中得到的经验教训及合成、结构生物学的进步中获得的将使我们能够创造出令人垂涎的NLRs。
总结要点
1.核苷酸结合富亮氨酸重复受体(NLRs)在sensor和helper中的亚功能化在不同物种中多次独立出现。
2.从NLR对进化而来的helper比CC-NLR (RNL)的helper在进化上要早。？？？
3.NLRs中sensor和helper信号元件的亚功能化与模式识别受体的受体和共受体的关系有关，这可能是一个普遍的进化主题。
4.虽然仅从序列上预测NLRs的作用模式是具有挑战性的，但在演化支中的系统发育位置可以帮助预测NLRs的遗传需求。
5.NLRs的设计一直很困难，到目前为止只取得了有限的成功。
6.理解NLRs的进化可以为设计工作提供信息，并指导设计人员设计具有新的识别特异性的NLRs。
未来的问题
1.为什么植物会失去某些NLR支系而扩展其他支系？
2.种内和种间的进化模式是否守恒。
3.人类和病原体的进化压力如何影响免疫基因的进化?这在不同的系统之间，包括在驯化系统和野生系统之间是一致的吗？
4.NLRs的调节是通过什么样的时间尺度和什么方式来进行？并且这种调节能随着环境的变化而变化以适应不同的生长损失?与NLR内的序列进化相比，这是以更快还是更慢的速度发生的?
5.为什么NLRs会细分为helpers和sensors?这个关系是如何工作的，这个复合物是如何被效应子激活的呢？
6.在EDS1(ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY 1)，PAD4(PHYTOALEXIN DEFICIENT 4)和RNL helpers这三者中有什么功能性联系？导致超敏反应(HR)的确切分子事件是什么?它在植物免疫中的作用是什么?
7.整合结构域(IDs)的功能是什么?例如，它们仅仅是病原体的诱饵，还是它们通过将NLR定位到正确的亚细胞区室来完成某种功能?
8.哪些NLR-IDs可以作为新的融合蛋白的平台?哪些guardees可以作为效应子目标结构的平台?
