动脉粥样硬化的发生是血管壁中多种细胞类型变化和相互作用的结果。在生理状况下，LDL由LDL-R受体识别结合后，内吞入细胞代谢。在动脉粥样硬化初始阶段，血管内皮细胞由于各种因素而明显受损，导致低密度脂蛋白（LDL）颗粒积聚在内膜下并氧化形成氧化的低密度脂蛋白（oxLDL）。同时，ox-LDL激活内皮细胞，表达白细胞粘附分子，吸引血液单核细胞进入到内膜下，被激活的内膜细胞，同时也会表达巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），使单核细胞分化成成熟的巨噬细胞。成熟的巨噬细胞会表达很多的模式识别受体，比如清道夫受体，ox-LDL会被清道夫受体识别、结合、内吞入细胞丧失正常胆固醇代谢途径，引起细胞内脂质沉积，形成巨噬细胞衍生的泡沫细胞。巨噬细胞对oxLDL的吞噬作用促进了炎症的发展，这些炎症因子和其他趋化因子刺激血管介质中平滑肌细胞从稳定的收缩型转变为去分化的合成型。与此同时合成型的血管平滑肌细胞向内膜下迁移、吞脂质形成VSMCs 源性泡沫细胞。这两种类型的泡沫细胞不断地聚集在一起，最终形成了富含脂质的动脉粥样硬化斑块的核心。
N6-甲基脱氧腺嘌呤（6mA）是DNA腺嘌呤6号位氮原子上的甲基化修饰，在多种生命体中具有重要的生物学调控功能。最初，6mA被发现主要存在于原核生物基因组中，用于区分自身基因组和外源DNA，保护自身DNA不被限制性内切酶性降解。近年来，6mA逐渐被发现存在于真菌、衣藻、果蝇和哺乳动物等真核生物基因组（gDNA）和线粒体DNA（mtDNA）中，其动态水平的变化调控了早期胚胎发育及线粒体转录，提示6mA是真核生物基因组中继5-甲基胞嘧啶（5mC, DNA甲基化）之后的又一个全新的表观遗传修饰，阐明其甲基化酶和去甲基化酶的分子机制对于深入理解6mA的基本生物学功能具有重要意义。
目前，甲基转移酶样蛋白4（METTL4）是哺乳动物中唯一已知的可以启动mtDNA 6mA甲基化的酶，主要富集于巨噬细胞线粒体。但是，mtDNA腺嘌呤6号位氮原子甲基化修饰是否参与生理病理过程研究很少，尤其如何参与AS进程尚无报道。因此，探索mtDNA腺嘌呤6号位氮原子甲基化修饰可能为治疗AS提供新的策略和干预靶点。
1. METTL4 Is Involved in the Progression of Atherosclerosis
为了明确mtDNA腺嘌呤6号位甲基化是否参与AS，作者使用ox-LDL分别给予HMDMs (人单核来源巨噬细胞)、HASMCs (人主动脉平滑肌细胞)、HAECs (人主动脉内皮细胞)构建体外AS细胞模型，并通过斑点印迹（dot-blots）发现，给予ox-LDL刺激后，只有巨噬细胞中mtDNA的腺嘌呤6号位氮原子甲基化修饰水平显著增高(a-c)。这表明，此类修饰主要富集在AS巨噬细胞中。METTL4是目前唯一已知参与调控此类修饰的甲基转移酶，然而其亚细胞定位尚不明确。因此，作者首先通过WB和超分辨荧光显微成像来明确METTL4的亚细胞定位。结果发现，METTL4主要存在在线粒体中(d, e)。此外，作者敲低了METTL4，发现其缺乏还能明显降低ox-LDL 刺激后的mtDNA的腺嘌呤6号位氮原子甲基化修饰水平(f)。在患者的主动脉组织中同样发现了METTL4的升高(g, h)。此外，与不易受损GC区相比，LC处的Mettl4和巨噬活化标志物如MCP-1, IL1B, TNFa表达都更高(i)。
随后，为了验证METTL4只存在于巨噬细胞的线粒体中。作者通过WB检测了不同细胞在给予ox-LDL后METTL4的表达，发现只有在HMDMs和BMDMs中METTL4的表达会在给予ox-LDL后显著升高，而在内皮细胞和平滑肌细胞中并无差异，并且METTL4与巨噬细胞共定位(j-k)。此外，作者也通过免疫荧光染色进一步分析了AS斑块中METTL4 的表达。发现在高脂饮食（HFD）喂养的小鼠中，METTL4在AS斑块巨噬细胞中高表达，并且其表达量随着CD68+细胞的增加而增加(l)。此外，随着AS的进展，外周血单核细胞中的METTL4的基因水平也越来越高(m)，同时，METTL4基因水平与IL-1β、TNF-α、MCP-1 和IL-6 呈正相关(n)。此外，作者还采用了核实时转录分析技术(run-on transcription technology)实时检测METTL4的转录效率，结果发现，给予ox-LDL刺激后，METTL4的转录是增加的(o)。综上所述，通过以上结果，作者首次证实METTL4介导的mtDNA腺嘌呤6号位甲基化富集于AS斑块巨噬细胞中，并与AS进程密切相关。
核实时转录分析技术run-on transcription technology的基本原理是在试管内，向细胞核提取物中加入放射性核素标记的NTP, 使其掺入到正在转录的 mRNA 分子中；再通过核酸分子杂交的方法，即可以同时鉴定出多个目标基因是否转录以及其转录的量。
2. Myeloid-Specific Deletion of METTL4 Reduces Atherosclerosis
为了功能性验证METTL4介导的mtDNA腺嘌呤6号位甲基化在AS中的作用，作者构建了METTL4巨噬细胞特异性敲除的Apoe-/-小鼠，并给予高脂喂养建立动脉粥样硬化小鼠模型。主动脉的油红染色显示，与flox小鼠相比，敲除METTL4后小鼠整个主动脉的AS斑块显著减少，同时小鼠的主动脉根部的脂质积累、斑块面积和坏死核心均有所减少(a-e)。此外，作者发现敲除Mettl4后小鼠AS斑块中的巨噬细胞含量显著下降，胶原蛋白含量、纤维帽厚度、平滑肌细胞含量显著增加，表明动脉粥样硬化斑块的稳定性增强。作者也发现，敲除Mettl4后小鼠腹膜巨噬细胞中甲基化水平明显下降。这些数据表明，髓系特异性敲除METTL4 能有效缓解AS的进展(f-j)。
3. METTL4 Activated Macrophage Inflammasome by Cytoplasmic mtDNA Released Through Mitochondrial Permeability Transition Pore Opening
接着作者对si-METTL4和oxLDL刺激的HMDM进行了RNA测序，发现敲低METTL4主要影响炎症反应(a-d)。
鉴于METTL4主要定位于线粒体且是目前已知唯一可以修饰mtDNA腺嘌呤6号位甲基化的催化酶，因此作者推测METTL4可能会通过调节线粒体功能来发挥下游的一些作用。因此，作者通过线粒体膜电位、Seahorse、电镜等进一步检测线粒体稳态。然后发现敲除METTL4后线粒体膜电位和耗氧率的降低、细胞外酸化速率的升高均被抑制(e-f)。线粒体肿胀、嵴断裂均被抑制。METTL4的缺乏也抑制了ox-LDL所导致的线粒体碎片的形成(g-h)。综上，缺失METTL4可显著恢复ox-LDL刺激的HMDMs的线粒体活性。
正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光；在化合物诱导线粒体膜电位崩溃时，由于膜电位的下降或丧失，JC-1只能以单体的形式存在于胞浆中，发出绿色荧光。此时向该细胞中加入荧光探针——钙黄绿素乙酰甲酯（calceinacetoxymethyl ester, 即CalceinAM；一种非极性染料，可以对活细胞进行荧光染色。）CalceinAM通过被动运输进入细胞内并在细胞质组分包括线粒体等中积累。CalceinAM在细胞内能被酯酶水解去除乙酰甲酯,生成没有膜通透性的极性荧光染料钙黄绿素（Calceinor Fluorexon），从而使Calcein滞留在细胞内以及线粒体中，使得细胞质包括线粒体等呈现强绿色荧光。再加入CoCl2用于淬灭细胞质中Calcein的绿色荧光。正常情况下线粒体的MPTP是关闭的，CoCl2不能进入线粒体，因此在正常细胞中只是胞浆中的Calcein被淬灭；但是损伤的细胞MPTP有一定程度的开放，此时CoCl2便可以进入线粒体，因此在损伤细胞中除了胞浆中的所有Calcein被淬灭外，线粒体中的Calcein也有不同程度的淬灭。
最近，有大量证据表明，线粒体损伤可能会导致线粒体DNA（mtDNA）通过线粒体通透性转换孔（mPTP）释放到细胞质中，从而激活炎症小体。
Mitochondrial DNA Release in Innate Immune Signaling
因此，作者检测了mPTP的开放以及胞浆DNA的含量，发现mPTP开放和胞浆中 DNA含量在给予ox-LDL后显著升高(附图)。此外，作者发现胞浆中 DNA主要是mtDNA(i)，也就是说，给予ox-LDL后，mtDNA的释放增加。同时，作者还发现敲除METTL4 可以减少胞浆mtDNA的含量(i)，并且在回补METTL4后胞浆中mtDNA的含量增加，并在给予mPTP抑制剂cyclosporin A后减少(j)。因此，作者得出一个结论：在ox-LDL 刺激的HMDMs 中，METTL4通过mPTP开放导致 mtDNA 释放。
确定胞浆中的dsDNA来源：qpcr检测cytoplasmic mtDNA (MT-ND1 和 MT-ND2), nuclear LINE1 elements (L1ORF1 和 L1ORF2), 以及
ribosomal gene (18SRRNA)。
由于RNAseq结果显示敲低METTL4主要影响炎症反应，作者使用wb验证了敲低METTL4可以抑制ox-LDL导致的Caspase-1 和IL-1β的活化(k)。为了进一步证实mtDNA是ox-LDL激活炎症小体的直接介质，作者从ox-LDL刺激的HMDMs中分离出mtDNA，然后转染到HMDMs 中。结果发现，回补METTL4后，mtDNA可以导致Caspase-1和IL-1β的明显活化，而脱氧核糖核酸酶I则抑制了这种活化(l)。综上，METTL4通过mPTP释放mtDNA进入细胞质促进巨噬细胞炎性小体活化。同时，作者通过Seahorse检测了AS小鼠的腹膜巨噬细胞的耗氧率和细胞外酸化速率，发现巨噬细胞METTL4敲除小鼠耗氧率增加、细胞外酸化速率降低，这提示线粒体能量代谢明显改善(m)。同时，mPTP开放减少，胞浆中的mtDNA 减少(n)。此外，免疫荧光染色显示，与flox小鼠相比，METTL4敲除小鼠斑块中的IL-1β 水平显著下降，斑块和血清中的炎症因子水平明显下降（o）。总之，这些发现表明，METTL4通过mPTP开放释放的细胞质mtDNA促进巨噬细胞炎性体活化，从而促进动脉粥样硬化的发生。
4. mtDNA 6mA Is the Critical Factor for METTL4 in the Regulation of Mitochondrial Dysfunction in ox-LDL–Stimulated Macrophages
为了进一步明确METTL4甲基转移酶活性在其介导巨噬细胞mtDNA腺嘌呤6号位甲基化中的作用，作者构建了METTL4酶活位点突变质粒。结果发现，METTL4酶活位点突变可显著抑制脂质诱导的mtDNA6mA 水平以及mtDNA的释放、线粒体功能损伤（包括膜电位降低、耗氧率降低、细胞外酸化速率升高、线粒体肿胀、嵴断裂的恢复）、炎症小体激活和炎症因子的表达；这一效果与mtDNA抑制剂Etbr（溴化乙锭）一致。因此，作者得出一个结论，METTL4的甲基转移酶活性可以通过影响胞质mtDNA的量影响巨噬细胞炎症(a-g)。
为了证实上述结论，作者进行了线粒体移植实验，以探索METTL4 是如何通过调节线粒体功能对炎性小体激活影响的。结果发现，给予ox-LDL刺激后的线粒体会导致线粒体能量代谢明显失调、线粒体膜电位降低、mtDNA6mA 水平升高、胞浆mtDNA 积累以及炎症因子产生增加，与回补METTL4 的效果相似。然而，移植ox-LDL刺激后的METTL4突变的线粒体则能显著抑制这些变化。因此，作者认为，ox-LDL这种脂质刺激会导致巨噬细胞中METTL4过表达，促进mtDNA腺嘌呤6号位甲基化修饰，进而损伤线粒体功能，导致mtDNA释放和炎性小体激活，而这一现象主要归因于METTL4的酶活功能。
5. METTL4-Mediated MT-ATP6 6mA Modification Mediated Excess Proton Accumulation in the Mitochondrial Intermembrane Space
mtDNA负责编码线粒体呼吸链复合物的13种亚基。
Mitochondrial DNA replication in mammalian cells: overview of the pathway
为了进一步探索METTL4是如何影响mPTP的开放进而影响线粒体功能和mtDNA释放的，作者检测了METTL4敲低前后呼吸链复合物的表达，发现敲低METTL4能显著增加线粒体呼吸链复合物V的活性(a: 表达，b: 活性)，尤其是其组分MT-ATP6的表达(c,d)。此外，作者发现，与敲低结果一致的是，METTL4 酶活位点突变可以挽救METTL4引起的MT-ATP6 表达下调(e-f)。此外，作者发现，MT-ATP6存在mtDNA 6mA 基序(g)，同时，METTL4促进MT-ATP6基因发生mtDNA腺嘌呤6号位甲基化修饰，从而降低转录因子TFAM与MT-ATP6基因的结合水平，减少其基因表达，进而影响线粒体功能(g)，突变METTL4则可以逆转这种现象(h)。
为了证实MT-ATP6 的关键作用，作者探究了ATP6 supplementation对ox-LDL 刺激的HMDMs 线粒体功能的影响。结果表明，ATP6过表达后可以恢ox-LDL导致的线粒体代谢功能障碍（细胞外酸化率和氧消耗率）、胞浆mtDNA积累、炎症激活以及炎症因子的表达(i-l)。ATP6是线粒体呼吸链复合体V的核心成分，通过利用质子梯度产生ATP。为进一步探讨METTL4是如何让通过调控ATP6进而调控线粒体功能的，作者首先检测了质子的亚线粒体定位。实验结果发现，过表达METTL4可增加脂质刺激引起的线粒体膜间隙质子积累，而补充ATP6可逆转这一现象。而此前文献报道，线粒体膜间隙的质子的积累会刺激mPTP的开放。因此，作者得出一个结论，METTL4可以通过调控mtDNA腺嘌呤6号位甲基化修饰抑制MT-ATP6表达，介导巨噬细胞线粒体膜间隙中过量质子的积累从而促进mPTP的开放，促进mtDNA的释放，进而使炎性小体活化(m)。
6. Myeloid-Specific Mutation in METTL4 Methyltransferase Active Site Reduced Atherosclerosis
为了探究在体内炎症巨噬细胞中METTL4催化活性对粥样硬化的影响，作者构建了酶活性位点突变小鼠。发现与Mettl4WT-Apoe-/- 小鼠相比，Mettl4MUT-Apoe-/- 小鼠的斑块减轻(a)，TEPMs的mtDNA 6mA修饰下降(b)，硬化灶的坏死和脂质沉积下降(c)，主动脉根部巨噬细胞减少，胶原沉积、纤维帽厚度和平滑肌数量增加(d,e)，炎症因子表达也下降(f)。
此外，突变后，小鼠巨噬细胞中MT-ATP6表达量增加，甲基化修饰减少，线粒体呼吸链复合物V活性增加，线粒体功能恢复，胞质mtDNA积累减少，炎症水平降低。这表明，METTL4甲基转移酶活性位点的突变可通过增加ATP6的表达，改善线粒体功能障碍和炎症小体激活来减少动脉粥样硬化(g-m)。
同时，作者通过骨髓移植证实接受酶活位点突变的METTL4移植的小鼠的主动脉斑块以及斑块内巨噬细胞含量显著减少。此外，MT-ATP6 6mA 修饰减少，MT-ATP6表达增加，线粒体呼吸链复合物V活性升高、胞质mtDNA减少、线粒体功能恢复和炎症水平降低。以上结果表明，在动物中METTL4亦可通过增加巨噬细胞中MT-ATP6DNA腺嘌呤6号位甲基化修饰，损害线粒体功能和激活炎性小体，从而加剧动脉粥样硬化(n-p)。
7. Pemetrexed Was Identified as the First METTL4 Antagonist Effective in Mitigating Atherosclerosis Progression
目前，还没有研究针对METTL4甲基转移酶活性的抑制剂。为了研究靶向METTL4酶活性作为治疗AS的潜在方案。作者进行多种药物化合物的高通量筛选。具体来说，作者通过虚拟筛选及计算机辅助筛选出结构和mettle4能够结合的化合物，进而进行酶活性检测得出能够降低活性的候选化合物。总之，作者找到了烟酸占替诺(XN)、培美曲塞(PEM)和利格列汀(Linagliptin)这三个化合物。然后，作者检测了MT-ATP6的表达以及炎症因子的水平，发现只有PEM可以减少MT-ATP6的6mA修饰，增加MT-ATP6的表达，抑制炎症因子的水平。证实了PEM是最适抑制剂。因此，作者对PEM进行了浓度梯度的摸索，确定75 nM 是其最佳浓度。
为了验证PEM的体内的治疗效果，通过给予AS小鼠模型8周不同剂量PEM治疗。结果表明，低剂量的PEM就可以显著减少主动脉斑块沉积、主动脉根部脂质积累，主动脉根部斑块的病变面积和坏死核心，增加胶原含量和纤维帽厚度。
为了进一步阐明PEM治疗AS的具体机制，作者发现，PEM可有效降低小鼠巨噬细胞mtDNA腺嘌呤6号位甲基化修饰，增加MT-ATP6表达，降低胞质mtDNA的含量，改善线粒体功能，降低炎症水平。以上结果首次证实PEM是METTL4活性抑制剂，可以通过降低巨噬细胞mtDNA腺嘌呤6号位甲基化减轻线粒体功能损伤和炎症，可能是治疗AS的新型有效化合物。
8. PROTAC-Pemetrexed Could Effectively Alleviate Atherosclerosis
蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)是一种新兴的治疗技术，通过泛素-蛋白酶体系统选择性诱导靶向蛋白质降解，其特点是高选择性、低副作用和低耐药性。基于结构化学，METTL4被预测为适合PROTAC介导的蛋白质降解的潜在药物靶点。因此，作者依据这个技术设计了一个小分子，可以靶向巨噬细胞降解METTL4（首先设计了一种选择性降解METTL4的PROTAC-PEM试剂，并将dMETTL4装载PLGA纳米颗粒，包被M2巨噬细胞膜，提高PROTAC-PEM对AS斑块中M1巨噬细胞的生物利用度和特异性）。作者首先发现，PROTAC-PEM可有效降解METTL4，给予蛋白酶体抑制剂MG132之后就不能降解了。有效降低MT-ATP6 DNA腺嘌呤6号位甲基化修饰，增加MT-ATP6表达、改善线粒体代谢功能障碍，减少mtDNA释放和炎症水平。
为了验证其体内药效，在动粥小鼠上给予了不同剂量的PROTAC-PEM。结果发现，它可显著减少主动脉斑块沉积、斑块中巨噬细胞的含量、炎症因子的表达。同时，发现mtDNA 6mA 水平降低，MT ATP6表达水平升高，线粒体 ROS 减少，胞质mtDNA减少、斑块中 IL-1β 水平显著下降。以上结果表明，作者首次证实工程化M2巨噬细胞膜包裹PROTAC-PEM可以通过靶向巨噬细胞中METTL4的降解成功应用于动脉粥样硬化治疗。
